1.1.1

Mobilization of endogenous stem cells

There are two neurogenic areas in humans: the subventricular zone (SVZ) and the dentate gyrus of the hippocampus. One potential source of neural stem cells for neural repair is through the mobilization of endogenous stem cells, which can be enhanced by various means (pharmacological agents, exercise…). Cerebral infarction itself results in the mobilization of SVZ cells with cell migration to the site of injury. In the hippocampus dentate gyrus, neurogenesis is enhanced by a variety of stimuli, including seizures, exercise and even antidepressants. In order to promote neural repair, after proliferation, endogenous stem cells need to migrate to appropriate sites and undergo differentiation to become functional mature cells.

1.1.2

Transplantation of embryonic human neural stem cells

A large number of studies have explored transplantation of neural stem cells and their progeny in experimental stroke models and in limited clinical investigations. However, none of these studies really compared the source of stem cells or the method for cell isolation and culture. For transplantation in humans, embryonic stem-cell-derived neural stem cells could be used but their manipulation in vitro is still very problematic. Drawbacks for using fetal tissue include cellular heterogeneity, inability to obtain sufficient numbers of donors, and difficulty in sample preparation. Additionally, it is now well known that embryonic stem cells could form terratomas on transplantation, so thus posing a major safety problem with the use of embryonic stem cell.

1.1.3

Transplantation of adult neural stem cells

Another source is the adult neural stem cells or progenitor cells. Same drawbacks of cell preparation apply here. For research experiment, these cells can be obtained from tissues detached during surgery in epileptic patients or during neurosurgical procedure to treat hydrocephalus. Surgery on the stroke patient himself could be considered if and even if culture conditions allow sufficient proliferation for autogenic transplantation. Different preparations give rise to varying proportions of neurons and glia after transplantation, but oligodendrocytes were rarely observed. These cells represent an immense potential but the challenge is still to understand neural progenitor mechanisms of growth and appropriate differentiation.

1.1.4

Transplantation of human neural cell lines and IPs cells

Pure, postmitotic human neuronal cells can be generated from the immortalized NT2 (ntera-2) cell line derived from a human teratocarcinoma on exposure to retinoic acid. These differentiated hNT cells (also known as NT2 N cells or LBS neurons, Layton Bioscience, Inc.) maintain their neuronal phenotype both in vitro and in vivo for > one year without reverting to a neoplastic state when tested in animals. However, survival of transplanted cells is not always correlated with functional recovery. This finding highlights the need to determine the parameters required for cell-enhanced functional recovery.

More recently, ReNeuron Group has developed a human neural stem cell line (CTX0E03) using the technology (c-mycERTAM) to achieve conditional growth control. Removal of the 4-OHT and growth factors in vitro , prior to in vivo implantation, allows to switch off the c-myc gene thereby removing growth promotion and permitting cell differentiation into the three neural lineage. The cell line has been tested in rodent stroke models and in normal nonhuman primates. A Phase I clinical trial has been done. No cell or immune-related adverse events have been reported in any of the patients treated to date. Last year, interim data from 11 patients treated in the PISCES study were presented by the clinical site team presented at The European Stroke Conference 2014, with sustained reductions in neurological impairment and spasticity observed in all patients compared with their stable pre-treatment baseline performance ( http://www.reneuron.com/press-release/interim-data-from-clinical-trial-of-reneuron-s-stem-cell-therapy-for-stroke-to-be-presented-at-leading-stroke-conference-longer-term-data-continue-to-show-good-safety-profile-and-evidence-of-sustained-reductions-in-neurologica ). They suggest that the 11 people included in the study still experienced no adverse effects and showed a modest improvement in stroke-related symptoms. However, this research is still at a very early stage, the effectiveness and safety of this new cell line still need to be proved on a larger group of stroke patients with a placebo control group.

Neuronal cells can be also obtained from induced pluripotent stem cells (IPS cells). hiPS cells can be produced from the patient’s skin fibroblasts, suggesting that iPS cells do not possess the immunoreactive problems associated with other cell sources. In addition, it has been reported that hiPS cells can differentiate into various kinds of neurons, including glutamatergic, motor and dopaminergic neurons and can survive after transplantation in the rodent brain. However, before developing iPS cell therapy in a clinical setting, their tumorigenicity is a critical problem that needs to be overcome. Strategy to develop IPS cells without exogenous gene integration is today a huge challenge for the development of cell therapy treatments.

1.1.5

Transplantation of bone marrow-derived stem cells

Another source is cells derived from the bone marrow. When exposed to selective growth factors, human BMSCs differentiate into cells expressing markers of neural progenitors. They also secrete numerous factors inducing neurotrophic effects, vascularization, stimulation of endogenous neurogenesis, and modulation of the host immune response. Ongoing clinical trials test in France, Spain, Brazil, and Great Britain autologous bone marrow stem cells in Middle Cerebral Artery Acute Stroke, which prevents immunologic rejection (see http://www.clinicaltrials.gov ). Also, SanBio Inc. develops human bone marrow–derived neuroprogenitor cells as an allogenic cell therapy for chronic, stable stroke and other neurodegenerative conditions. These cells transiently genetically modified to differentiate into cells with neural characteristics, have been evaluated in several rodent and primate studies . These studies are ongoing or demonstrate feasibility and safety of this approach .

1.2.1

General mechanisms

Various mechanisms may be responsible for the transplanted cell-mediated effect: integration into the host circuitry, reduction of death of host cells by inhibiting apoptosis in the penumbra, remyelinisation, induction of host plasticity, increased neovascularization, attenuation of inflammation, recruitment of endogeneous progenitors . For example, cellular transplants could modulate the sprouting of spared axons and the regeneration of disrupted axons by providing neurotrophins or acting on axon growth cone inhibitors, such as Nogo-A. This phenomenon has been observed in spinal cord injury models . Among these mechanisms, an attempt to recreate a new neuronal circuit seems more formidable than to use repair techniques to increase the efficacy of surviving circuits. Axonal reconnection through the grafted cells/tissues (serving as a cellular-bridge) over large distances is more complex, although has been observed in some animals with brain lesions . The function of the recruitment of endogenous cells has yet to be determined but may signify a natural repair mechanism of the brain that could potentially be further enhanced by transplanted cells.

As for induction of host plasticity, in the cortex, exogenous cells could create, augment, or extend in time endogenous peri-infarct and remote molecular signals, such as those for neurogenesis, cell differentiation, axonal and dendritic sprouting, probably strengthening of existing synapses, activation of silent synapses, network connectivity, and long-term potentiation, as well as deliver of engineered genes and provide replacement cells in a network. A review details the molecular pathways activated by these therapies, which induce remodelling of the injured brain via angiogenesis, neurogenesis, and axonal and dendritic plasticity . Delivery of growth factors by grafted stem cells could promote post-stroke plasticity including ipsilesional and contralesional plasticity. A recent study showed that human neural progenitor cell treatment could significantly increase dendritic plasticity in both the ipsi- and contralesional cortex through production of endothelial growth factor, thrombospondins 1 and 2, and axon guidance factors (slit). This coincided with stem cell-induced functional recovery . In another studies, rats displayed newly generated interhemispheric corticostriatal or corticorubral tracts that could be involved in motor recovery , or corticospinal fiber crossing in the spinal cord (1–2%) which positively correlated with better endpoint forepaw function . Therapeutic cells may be capable of enhancing fundamental mechanisms for learning or relearning after stroke within circuits that they reconstruct or modulate .

New connections, however, may not contribute to clinically useful sensorimotor activity without rehabilitative training. New sprouts may also create aberrant connections that either have no effect or even lessen function in the newly modulated circuit . Thus, to really achieve functional repair after cell transplant, we need to better understand how to get the cells to become functionally active.

1.2.2

Promoting ipsilesional activity

Ipsilesional sprouting, plasticity, and even long-distance regeneration are possible even in the adult central nervous system after a lesion . Stroke induces a unique microenvironment for axonal sprouting in peri-infarct cortex, in which growth-inhibitory molecules are reduced for one month after the infarct . Thus, this post-lesional plasticity is latent but inhibited thereafter because of the non-permissive nature of the CNS tissue environment. However, it seems to be re-inducible pharmacologically or by graft of stem cells . Yilmaz et al. described remarkable induction of genes for nerve guidance survival (e.g., cytokine receptor-like factor 1, glypican 1, Dickkopf homolog2, osteopontin), as well as increased expression of neurogenerative, nerve guidance, and angiogenic factors (bone morphogenetic protein [bFGF], angiopoietins, neural growth factor), after transplantation with bone marrow stromal cells . Short-distance projections of a graft into the host tissues (substantia nigra, thalamus…) have been demonstrated in several studies although few were found. Long-distance projections to the spinal cord like corticospinal fibers also occurred, not in all but in some mice transplanted with a mouse foetal cortex into the ablated M1 . Closer to our experiment, a major study showed that human telencephalic neuroblasts implanted in a brain lesion of adults rats extend axons along major myelinated fiber tracts for distance up to 20 mm, putatively the corticospinal and striato-nigral tracts . Finally, intraventricular infusions of epidermal growth factor and erythropoietin together promoted substantial regeneration of the damaged motor cortex, mobilized endogenous adult neural stem cells and improved recovery of motor skill. Removal of the regenerated cortical tissue reversed the growth factor-induced functional recovery .

Regenerating some tissue in a lesion would rather stimulate ipsilesional post-ischemic plasticity and initiate appropriate connections with the host like corticospinal tracts . Enhancing this ipsilesional plasticity by other means like rehabilitation, stimulation or drugs has been shown to correlate with better recovery in stroke patients .

2.1.1

Mobilisation des cellules souches endogènes

Chez l’homme il existe deux aires neurogènes : la zone sous-ventriculaire (ZSV) et le gyrus dentelé de l’hippocampe. Une source potentielle de cellules souches neurales, pour la réparation neuronale, est la mobilisation des cellules souches endogènes, qui peut être améliorée de différentes manières (médicaments, exercice…). L’infarctus cérébral (ou AVC ischémique) résulte d’une mobilisation de cellules ZSV associée à une migration des cellules vers le lieu de la lésion. Dans le gyrus dentelé, la neurogenèse est augmentée par une variété de stimuli, y compris les convulsions, l’exercice et même les antidépresseurs. Afin de favoriser la réparation neuronale, après prolifération, les cellules souches endogènes doivent migrer vers les lieux appropriés et se différentier afin de devenir des cellules matures fonctionnelles.

2.1.2

Transplantation de cellules souches neurales embryonnaires humaines

Plusieurs études se sont focalisées sur la transplantation de cellules souches neurales et leurs progéniteurs dans des modèles expérimentaux d’AVC dans des travaux expérimentaux limités. Cependant, aucune de ces études n’a comparé la source de ces cellules souches ou la méthode utilisée pour isoler les cellules et les mettre en culture. Pour la transplantation chez l’homme, des cellules souches neurales dérivées de cellules souches embryonnaires pourraient être utilisées mais leur manipulation in vitro se révèle extrêmement problématique. Avec le tissu fœtal les inconvénients sont l’hétérogénéité cellulaire, l’incapacité d’obtenir un nombre suffisant de donneurs, et la difficulté de la préparation de l’échantillon. De plus, il est maintenant reconnu que les cellules souches embryonnaires peuvent former des tératomes lors de la transplantation, constituant un problème majeur de sécurité pour l’utilisation des cellules souches embryonnaires.

2.1.3

Transplantation de cellules souches adultes

Les cellules souches neurales adultes ou cellules progénitrices représentent une autre source. Les mêmes inconvénients de préparation cellulaire s’appliquent également dans ce cas. Pour la recherche expérimentale, ces cellules peuvent être obtenues à partir de tissus prélevés en peropératoire chez les patients épileptiques ou durant une procédure neurochirurgicale pour traitement de l’hydrocéphalie. La chirurgie sur le patient hémiplégique pourrait être envisagée, lorsque les conditions de culture cellulaire permettent une prolifération suffisante pour une greffe autogène. Les différentes préparations entraînent des proportions variées de neurones et cellules gliales après transplantation, cependant des oligodendrocytes ont rarement été observés. Ces cellules représentent un potentiel immense, le challenge cependant réside dans la compréhension des mécanismes de croissance et de différentiation de ces cellules neurales progénitrices.

2.1.4

Greffe de lignées cellulaires neurales humaines et cellules souches pluripotentes induites (IPs)

Des cellules humaines neuronales post-mitotiques pures peuvent être générées à partir de la lignée cellulaire NT2 dérivée d’un tératocarcinome après exposition à l’acide rétinoïque. Ces cellules hNT différenciées (également connues sous les noms de cellules NT2N ou neurones LBS, Layton Bioscience, Inc.) conservent leur phénotype neuronal in vitro et in vivo au-delà d’un an sans retourner à l’état néoplasique, lors de tests chez l’animal. Cependant, la survie des cellules greffées n’est pas toujours corrélée à une récupération fonctionnelle. Ce résultat montre le besoin de déterminer les paramètres requis pour la récupération fonctionnelle via thérapie cellulaire.

Plus récemment, le groupe ReNeuron a développé une lignée cellulaire humaine de cellules souches neurales (CTX0E03) en utilisant la technologie (c-mycERTAM) permettant le contrôle de la croissance cellulaire. Le fait d’enlever in vitro le facteur 4-OHT et le facteur de croissance in vitro, avant l’implantation in vivo, permet d’inhiber le gène c-myc et donc d’inhiber la croissance cellulaire et faciliter la différentiation en trois lignées neuronales. La lignée cellulaire a été testée sur des modèles murins post-AVC et chez des primates sains. Un essai clinique de phase I e été mené. À ce jour aucun effet indésirable, au niveau cellulaire ou au niveau immunitaire, n’a été rapporté pour aucun des patients traités. Les données intermédiaires des 11patients traités dans l’étude PISCES étaient présentées à l’European Stroke Conference 2014par l’équipe investigatrice, ces données soulignaient une réduction durable des déficits neurologiques et de la spasticité chez ces patients, comparés à leurs performances stables prétraitement ( http://www.reneuron.com/press-release/interim-data-from-clinical-trial-of-reneuron-s-stem-cell-therapy-for-stroke-to-be-presented-at-leading-stroke-conference-longer-term-data-continue-to-show-good-safety-profile-and-evidence-of-sustained-reductions-in-neurologica ). Ces résultats montrent que pour ces 11patients inclus dans l’étude, aucun effet indésirable n’était rapporté, de plus une amélioration modeste des symptômes post-AVC est notée. Cependant, pour cette recherche naissante, l’efficacité et la sécurité de cette nouvelle lignée cellulaire doivent être validées sur une large cohorte de patients et faire l’objet d’une étude contrôlé avec groupe témoin placebo.

Les cellules neuronales peuvent également être obtenues à partir des cellules pluripotentes induites (cellules IPS). Les cellules humaines pluripotentes induites (hiPS) peuvent être extraites des fibroblastes cutanés du patient, suggérant que les cellules iPS ne possèdent pas les problèmes d’immunoréactivité associés aux autres sources cellulaires. De plus, certains auteurs rapportent que les cellules hiPS peuvent se différentier en plusieurs types de neurones, y compris glutamatergiques, moteurs et dopaminergiques, et survivre après transplantation dans le cerveau du rongeur. Cependant, avant de développer une thérapie cellulaire iPS dans un contexte clinique, leur tumorigénicité demeure une problématique cruciale qui se doit d’être résolue. La stratégie visant à développer des cellules iPS sans intégrer de gêne exogène est aujourd’hui un challenge pour le développement de traitements liés à la thérapie cellulaire.

2.1.5

Transplantation de cellules souches de moelle osseuse

Les cellules souches de moelle osseuse (CSMO) sont une autre de ces sources. Une fois exposées à des facteurs de croissances sélectifs les CSMO humaines se différentient en cellules exprimant des marqueurs de cellules progénitrices neurales. Elles sécrètent alors plusieurs facteurs entraînants des effets neurotrophiques, une vascularisation, une stimulation de la neurogenèse endogène et la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte. Des études cliniques sont actuellement en cours en France, Espagne, Brésil et Royaume Uni sur les cellules souches de moelle osseuse autologues dans l’AVC de l’artère cérébrale moyenne, pour prévenir la réjection immunologique (voir http://www.clinicaltrials.gov ). De plus, SanBio Inc. développe des cellules neuro-progénitrices de moelle osseuse dans le cadre de thérapie cellulaire allogène pour le patient hémiplégique chronique et stable (AVC) et d’autres affections neurodégénératives. Ces cellules temporairement modifiées génétiquement afin de se différentier en cellules ayant des caractéristiques neurales, ont été évaluées dans plusieurs études sur les primates et les rongeurs . Ces études sont en cours ou montrent la faisabilité et la sécurité de cette approche .

2.2.1

Mécanismes généraux

Plusieurs mécanismes sont responsables de l’effet lié à la transplantation cellulaire: intégration dans le circuit hôte, réduction de la mortalité des cellules hôtes par inhibition de l’apoptose dans la pénombre ischémique, remyélinisation, induction d’une plasticité chez l’hôte, augmentation de la néovascularisation, réduction de l’inflammation et recrutement de cellules progénitrices endogènes . Par exemple, les greffes cellulaires pourraient moduler le bourgeonnement des axones non atteints et la régénération des axones perturbés en fournissant des neurotrophines ou en agissant sur les facteurs inhibiteurs des cônes de croissance, comme le Nogo-A. Ce phénomène a été observé dans des modèles de lésion médullaire . Parmi ces mécanismes, il est plus ambitieux de recréer un nouveau circuit neuronal plutôt que d’utiliser des techniques de réparation afin d’augmenter l’efficacité des circuits survivants. La reconnection neuronale longues distances par les tissus/cellules greffés (servant de pont cellulaire) est plus complexe, bien que cela fut mis en évidence chez certains animaux cérébrolésés . Le rôle du recrutement des cellules endogènes doit encore être précisé, mais il pourrait sous-tendre un mécanisme naturel de réparation du cerveau, permettant éventuellement une amélioration grâce aux greffes cellulaires.

Quant à l’induction de la plasticité chez le receveur, dans le cortex, les cellules exogènes pourraient créer, augmenter ou prolonger les signaux endogènes périlésionels et les signaux moléculaires à distance, tels que ceux promouvant la neurogenèse, la différentiation cellulaire, le bourgeonnement axonal et dendritique, et probablement renforcer les synapses existantes, activer les synapses silencieuses, la connectivité du réseau et la potentiation au long terme, mais aussi délivrés des gènes modifiés et fournir des cellules de remplacement au sein d’un réseau. Une revue de la littérature détaille les voies moléculaires activées par ces nouvelles thérapies, qui induisent un remodelage du cerveau lésé via l’angiogenèse, la neurogenèse et la plasticité axonale et dendritique .

La libération des facteurs de croissances par les cellules souches greffées pourraient promouvoir une plasticité post-AVC y compris une plasticité ipsi- et contralésionnelle. Une étude récente montre que la thérapie cellulaire à base de cellules progénitrices neurales humaines augmente la plasticité dendritique au sein du cortex ipsi- et contralésionnel à travers la production de facteur de croissance endothélial, de thrombospondines 1 et 2 et des facteurs de guidage axonal (voie slit). Ceci coïncide avec la récupération fonctionnelle induite par les cellules souches . Dans d’autres études chez le rat, les auteurs rapportent la génération de nouveaux faisceaux interhémisphèriques corticostrial ou corticorubral pouvant être impliqué dans la récupération motrice , ou de fibres corticospinales dans la moelle épinière (1 à 2 %) positivement corrélée avec la récupération fonctionnelle de la patte avant . Les cellules thérapeutiques sont capables d’augmenter les mécanismes fondamentaux d’apprentissage ou de réapprentissage post-AVC au sein des circuits qu’elle reconstruisent ou modulent .

Cependant, ces nouvelles connections peuvent ne pas se révéler cliniquement pertinentes pour l’activité sensorimotrice en l’absence de rééducation fonctionnelle. Des nouveaux bourgeons peuvent également créer des connections aberrantes qui se révèleront soit sans effet ou pouvant même diminuer la fonction dans le circuit nouvellement formé . Ainsi, afin de réellement obtenir une récupération fonctionnelle après greffe cellulaire, il nous faut améliorer nos connaissances sur les mécanismes qui rendent les cellules fonctionnellement actives.

2.2.2

Favoriser l’activité ipsilésionnelle

Le bourgeonnement et la plasticité ipsilésionnelle, ainsi que la régénération longue distance sont possibles même au sein du système nerveux central de l’adulte après lésion . L’AVC déclenche un microenvironnement unique favorisant le bourgeonnement axonal dans le cortex périlésionel, où les molécules inhibitrices de croissances sont réduites pendant le mois qui suit l’AVC . Ainsi, cette plasticité post-lésionnelle est latente mais inhibée à cause de la nature non-permissive de l’environnement tissulaire du SNC. Cependant, il semble possible d’inverser cette non-permissivité à l’aide de traitements pharmacologiques ou par greffe de cellules souches . Dans leur étude, Yilmaz et al. décrivent une induction remarquable de gènes de survie du guidage neuronal (récepteurs de cytokine-like de classe 1 CRLF1, glypticien 1, protéine Dickkopf homologue2 [DKK2], ostéopontine), ainsi qu’une augmentation de l’expression des facteurs neurogénératifs, angiogéniques et de guidage neuronal (bFGF, protéine morphogénétique osseuse, angiopoiétines, facteur de croissance neurale)après une greffe de cellules stromales de moelle osseuse . Plusieurs études ont démontré des projections à courte distance de la greffe sur les tissus hôtes (substantia nigra, thalamus…) bien que peu de fibres soient réellement mises en évidence. Il existe également des projections longue distance jusqu’à la moelle épinière comme pour les fibres corticospinales, pas chez toutes mais chez certaines souris greffées avec du cortex fœtal murin dans le territoire M1 excisé . Plus proche de nos travaux, une étude majeure montre que les neuroblastes humains télencéphaliques implantés dans le territoire d’une lésion cérébrale de rats adultes, projettent des axones le long des principaux faisceaux de fibres myélinisées sur une distance allant jusqu’à 20 mm, probablement le long du faisceau corticospinal et du faisceau striato-nigral . Enfin, les perfusions intraventriculaires de facteur de croissance épidermique associées à l’érythropoïétine permettent une régénération substantielle du cortex moteur lésé, mobilisant les cellules souches neurales adultes endogènes et améliorant ainsi la récupération des fonctions motrices. L’ablation du tissu cortical régénéré inverserait le processus de récupération induite par le facteur de croissance .

Le fait de régénérer certains tissus au sein d’une lésion semble stimuler la plasticité ipsilésionnelle post-ischémique et initier les connections requises avec l’hôte comme pour les faisceaux corticospinaux . De plus, il existe une corrélation entre l’augmentation de cette plasticité ipsilésionnelle via d’autres méthodes, telles que la rééducation fonctionnelle, la stimulation ou les médicaments, et une meilleure récupération chez le patient hémiplégique .